توضیحات
کیت سنتز cDNA یک ابزار آزمایشگاهی ضروری است که برای تبدیل RNA به DNA مکمل (cDNA) استفاده می‌شود. این فرآیند که رونویسی معکوس (Reverse Transcription) نام دارد، گامی کلیدی در بسیاری از تحقیقات زیست‌شناسی مولکولی، به ویژه در مطالعات بیان ژن است.
چرا از کیت سنتز cDNA استفاده می‌شود؟
سلول‌های یوکاریوتی پس از رونویسی، بخش‌های غیرکدکننده (اینترون‌ها) را از mRNA حذف می‌کنند. از آنجایی که ژنوم DNA حاوی این اینترون‌ها است، استفاده مستقیم از آن برای بررسی بیان ژن می‌تواند گمراه‌کننده باشد. با تبدیل mRNA به cDNA، تنها توالی‌های کدکننده (اگزون‌ها) حفظ می‌شوند. سپس این cDNA می‌تواند به عنوان الگویی برای تکنیک‌های پایین‌دستی مانند واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) و qPCR استفاده شود.
محتویات و مکانیزم عمل:
یک کیت سنتز cDNA معمولاً حاوی اجزای زیر است:
-
آنزیم رونوشت‌بردار معکوس (Reverse Transcriptase): این آنزیم اصلی‌ترین جزء کیت است و مسئول سنتز رشته DNA مکمل (cDNA) از روی الگوی RNA است.
-
پرایمرها: انواع مختلفی از پرایمرها وجود دارد که هر کدام هدف خاصی را دنبال می‌کنند:
-
پرایمر اولیگو(dT) (Oligo(dT) Primer): این پرایمر به دم پلی(A) در انتهای 3' مولکول‌های mRNA یوکاریوتی متصل می‌شود و فقط mRNA را رونویسی می‌کند.
-
هگزامرهای تصادفی (Random Hexamer Primers): این پرایمرها به صورت تصادفی به توالی‌های RNA متصل می‌شوند و می‌توانند از روی کل جمعیت RNA (شامل mRNA و سایر RNAها) cDNA بسازند.
-
پرایمرهای ژن‌اختصاصی (Gene-Specific Primers): این پرایمرها برای رونویسی یک ژن خاص طراحی شده‌اند.
-
مهارکننده RNase: این آنزیم برای محافظت از RNA الگو در برابر تخریب، به ویژه در دماهای بالا، به محلول واکنش اضافه می‌شود.
-
نوکلئوتیدها (dNTPs): واحدهای ساختاری لازم برای سنتز رشته cDNA هستند.
-
بافر واکنش: محیط شیمیایی مناسبی برای عملکرد بهینه آنزیم‌ها فراهم می‌کند.
